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http://www.abbs.info e-mail:[email protected] ISSN
0582-9879
ACTA BIOCHIMICA et
BIOPHYSICA SINICA 2003, 35(8): 752–755
CN 31-1300/Q |
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Short Communication |
Morphological
Observation on Fibronectin Fibrils Surrounding Human Breast Carcinoma Cells by
Atomic Force Microscopy
CHEN
Yong1,2, CAI Ji-Ye1*
( 1College of Life Science and
Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2Anhui Institute of Optics and
Fine Mechanics, the Chinese Academy of Sciences, Hefei 230031, China)
Abstract This report aimed at investigation
on the application of atomic force microscope (AFM) in research on interaction
between cells and extracellular matrix, and function of extracellular matrix.
Distribution and array of fibronectin fibrils surrounding human breast
carcinoma MCF-7-R cells were observed by atomic force microscope, and
comparison of AFM with other traditional techniques was performed. Whole and
local AFM morphological images of several human breast carcinoma MCF-7-R cells
and fibronectin fibrils around cells were obtained by AFM. Distribution and
array of fibronectin fibrils were found to be very regular, and the regulated
array coordinated with functions of fibronectin fibrils very well. Owing to
advantages of simple sample preparation and very high resolution, AFM is an
ideal tool to in situ observation of extracellular matrix.
Key
words atomic force
microscope; human breast carcinoma cells; fibronectin; fibril
__________________________________________
Received:
March 24, 2003 Accepted:
May 19, 2003
This
work was supported by the grants from the Major State Basic Research
Development Program of China (973 Program) (No. 2001CB510101), Key Programs of
the National Science Foundation of China (No. 30230350), the National Science
Foundation of China (No. 60278014), Key Program of Science and Technology
Foundation of Ministry of Education of China (No. 00124)
*Corresponding
author: Tel, 86-20-85226262; e-mail, [email protected]
AFM对人乳腺癌细胞外纤连蛋白原纤维的形态学观察
陈勇1,2 蔡继业1*
( １暨南大学生命科学与技术学院, 广州 510632; ２中科院安徽光学精密机械研究所, 合肥 230031 )
摘要 探讨原子力显微镜在研究细胞和细胞外基质间的相互作用及细胞外基质的功能等方面的应用前景。 应用原子力显微镜观察培养的人乳腺癌MCF-7-R细胞分泌的纤连蛋白原纤维的分布和排列规律, 并与其他常规观察技术进行比较。 应用原子力显微镜获得了多个乳腺癌细胞和细胞外纤连蛋白原纤维的整体和局部形貌图像, 发现这些原纤维的分布和排列方式非常有规律, 而且这些规律与其功能相适应。 由于样品制备简单和分辨率较高等优点, 原子力显微镜较适合于细胞外基质的原位观察。
关键词 原子力显微镜(AFM); 人乳腺癌细胞; 纤连蛋白;
原纤维
目前已知纤连蛋白的主要功能是介导细胞粘着。
纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的增强粘连。 通过增强粘连,
纤连蛋白可以调节细胞的形状和细胞骨架的组织, 促进细胞铺展[1]。 一般认为, 纤连蛋白基质纤维为细胞的运动提供了轨道。
在胚胎发生过程中, 纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的[2,3]。
在创伤修复中, 纤连蛋白亦很重要[4～7],
如促进巨噬细胞、血小板和其他免疫细胞迁移到受损部位。 在研究中,
由于受技术的限制, 大多数只报道了纤连蛋白的功能, 对于其在粘附状态下的形态结构还不太清楚。
然而, 蛋白质的功能是与结构相适应的, 因此其形态结构必然有与其功能相适应的规律。
由于原子力显微镜(AFM)有高分辨率等特点, 已有很多研究应用它来探讨单个纤连蛋白分子的结构和功能。 例如, 1998年, Rief等[8]研究了纤连蛋白Ⅲ型结构域的稳定性; 1999年, Paci等[9]研究了纤连蛋白的分子动力学; 2000年,
Lin等[10]观察了纤维粘连蛋白分子在肝磷脂的结合位点; 2001年, Craig等[11]应用AFM比较了纤连蛋白Ⅲ型结构域的几个早期去折叠阶段等等。 在纤连蛋白纤维化方面, 已有非常多的文献, 报道用各种其他技术研究其纤维化的成因[12～15], 但据我们所知, 目前还未见应用原子力显微镜观察细胞外纤连蛋白原纤维的分布和排列的报道。
本实验主要通过原子力显微镜来观察乳腺癌细胞分泌的纤连蛋白在细胞周围的分布和排列状况, 及与其功能的适应性。
1 材料和方法(Materials
and Methods)
耐药乳腺癌细胞株MCF-7-R来源于广州(暨南)生物医药研究开发基地。 细胞在预先放置有洁净、无菌的盖玻片的6孔板中培养。 培养液为DMEM完全培养基(含10%小牛血清, 2 mol/L谷氨酰胺,
100 u/mL青霉素, 100 mg/L链霉素), 于37
℃, 5% CO2, 95%空气, 100%湿度下培养。 取出贴附有细胞的盖玻片, 用pH
7.5的PBS缓冲液轻轻漂洗3次,
1.5%的戊二醛固定30 min, 再用PBS漂洗3次, 干燥后进行AFM观察。 将有新制备样品的盖玻片固定在AFM(Autoprobe CP Research,
Thermomicroscopes公司, 美国)的XY扫描台上, 用监视器定位所要扫描的样品区域, 在空气中应用AFM对样品进行扫描成像。 实验采用100
μm扫描器, 轻敲模式(tapping
mode), UL20B硅探针, 力常数为2.8 N/m。 用仪器配置的软件(thermomicroscopes proscan image
processing software version 2.1)进行图像数据的采集和处理, 所有图像只进行平滑处理。
2结果(Results)
应用原子力显微镜我们获得了乳腺癌细胞和细胞外纤连蛋白原纤维的整体和局部形貌图像(如图1所示)。
图1(A)为三个乳腺癌细胞和细胞外纤连蛋白原纤维的整体形貌图像,图1(B)～(F)分别为图1(A)中各局部放大的形貌图像。
图1(A)中白色短箭头所示是起细胞间粘连作用的较粗而长的原纤维。 当细胞旁边有其他细胞时,
这一侧的原纤维分布较多; 当细胞旁边没有其他细胞时(如白色长箭头所示),
原纤维分布较少。 图1(B)和1(D)中可见较细而短的排列整齐的原纤维。
图1(E)为两个细胞间的连接部位, 旁边环绕着原纤维。
图1(F)为没有粘着其他细胞的细胞铺展部位, 可见吸盘状(或叫伪足状)的结构, 有些原纤维起始于细胞的上部而不是边缘(如黑色短箭头所示)。
Fig.1 Whole and local AFM morphological images of several human breast carcinoma MCF-7-R cells and fibronectin fibrils around cells
(A) Whole image (50 μm,
bar=5 μm). Short white arrows show thick and
long fibrils, and long white arrows show sides of cells beside where there are
no other cells. (B)－(F)
Local images of areas surrounded by the black squares (8 μm,
bar=1 μm). The short black arrow shows fibrils
starting at parts upon cells.
对图1(A)中右上角的细胞膜表面做更小范围的局部扫描, 得到图2所示的4个AFM形貌图像。 只有图2(D)中的细胞膜表面有纤连蛋白原纤维[如图2(D)中黑色短箭头所示], 也说明了有有些原纤维起始于细胞的上部, 而不是细胞与基片相贴近的边缘基部。
Fig.2 AFM morphological images of different areas on membrane surface of the cell at the top right corner of Fig.1(A)
Fibrils
can be found only in figure (D) (showed by black arrows). Scanning size: 3 μm;
bar, 250 nm.
根据实验观察结果,
我们建立了乳腺癌细胞外纤连蛋白原纤维分布和排列的模型图(见图3)。 图中蓝色线条表示主要起细胞与基片间粘连作用的短而细的原纤维, 红色线条表示起细胞间及细胞与基片间粘连作用的长而粗的原纤维。 箭头所示为伪足状结构。
Fig.3 Schematic representation of distribution and array of fibronectin fibrils surrounding human breast carcinoma MCF-7-R cells
(A) Before attachment (globular). (B) After
attachment. Blue lines represent slender and short fibrils which play an
important role in attachment between cells and substrate. Red lines represent
thick and long fibrils which play an important role in attachment between cells
or between cells and substrate. Small arrows show the pseudopod-like
structures.
3 讨论(Discussion)
许多培养细胞能够分泌纤连蛋白[16], 使细胞附着于支持底物上生长, 许多肿瘤细胞亦如此。 本研究应用原子力显微镜观察到耐药乳腺癌细胞株MCF-7-R分泌的纤连蛋白原纤维。
从实验结果可看出(如图1所示),
在生长于盖玻片上的乳腺癌细胞周围, 纤连蛋白原纤维的分布和排列具有与其功能相适应的规律。 第一,
这些原纤维主要分为两类： 一类原纤维较细而短,
主要起将细胞粘附于基片的作用, 在图3模型图中以蓝线表示;
另一类原纤维较粗而长, 同时起细胞间和细胞与基片间的粘附作用, 在图3模型图中以红线表示。
第二, 这些原纤维的排列整齐而有规律： 在细胞的铺展部位,
原纤维交错而层叠, 往往形成一个吸盘状(或叫伪足状)的结构; 而在细胞的侧面位置,
原纤维整齐并排成单层。 原纤维的这些排列方式使得细胞能够非常牢固地粘附于支持底物上, 并使得细胞有进一步铺展的趋势。
第三, 当细胞某侧邻近有其他细胞时, 该侧面的原纤维较多,
相反则较少。 纤连蛋白原纤维的这种分布方式, 使得细胞间有一种相互移动和靠拢的趋势。 第四,
在细胞与细胞相接的部位, 长而粗的原纤维分布较多, 主要起细胞间粘连及细胞间相互靠拢的作用。
第五, 纤连蛋白原纤维不但起始于细胞贴近基底的部位, 有些纤维还起始于细胞上面而非基部。 由于原子力显微技术的限制,
还无法观测到细胞底部(即细胞与基底相贴的部位)是否有原纤维,
以及其分布和排列方式如何。 贴壁前,
细胞呈球形, 且细胞间相互分离, 而贴壁培养一段时间后,
细胞铺展成各种形状, 且很多细胞间相互连接。 细胞贴壁前后的这些形态学变化完全依赖于纤连蛋白原纤维的作用, 而这些作用又完全靠原纤连蛋白原纤维的分布和排列方式所产生的多种合力, 这些合力使得细胞粘附、铺展、生长和迁移, 甚至可能与突触的产生有关。
原子力显微术是上个世纪80年代发展起来的新技术, 具有样品制备简单和分辨率高等优点, 被广泛地应用于物理、化学、生命科学和医学等领域。 本研究主要就是利用这两个优势达到了观察目的。
样品制备时, 生长在基片上的细胞仅仅经过戊二醛的短时间固定和几次漂洗, 所以细胞分泌的纤连蛋白原纤维仍然较完整地保留在原来的位置; 由于AFM的高分辨率,
才能清楚地观察到这种蛋白原纤维的精细结构及其分布和排列。 而传统的普通光学显微镜或共聚焦显微镜只能看到细胞的形态, 无法观察到细小的纤连蛋白原纤维, 经过荧光标记后, 荧光显微镜和共聚焦显微镜等虽然能够看到原纤维, 却不精细, 不易分辨出这些原纤维的排列状况[17]。 电子显微镜虽具有非常高的分辨率, 但由于其样品制备的复杂, 很难保持纤连蛋白原纤维的原始位置, 或者原纤维在取材、固定、脱水等过程中部分或全部丢失。 原子力显微镜的这些优势,
使得其在研究细胞和细胞外基质间的相互作用及细胞外基质的功能等方面的应用成为可能。
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